《华东六省一市生物化学与分子生物学会联盟2019年学术与教学交流会摘要集》2019年
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猪细胞色素P4503A22在乙酞甲喹解毒代谢中的功能研究

欧阳满  
【摘要】:乙酰甲喹(Mequindox)是80年代我国人工自主合成的广谱抗菌药物,在我国被广泛用作抗菌剂和畜禽饲料添加剂,然而它对宿主的潜在毒性作用还存在很大的未知性,有必要对其安全性进行深入评估。乙酰甲喹的主要代谢场所肝脏含有大量的酶类,其中,细胞色素P450酶所占比例最高。细胞色素P450酶(CYP450),是一种结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶,是生物体内主要的解毒酶系,负责外源性物质及内源性物质的生物转化,在解毒和生物活化中起着重要作用。目的:乙酰甲喹作为一种抗菌剂,它还具有加速动物合成蛋白质、促进禽畜生长的作用,因而在我国被广泛作为饲料添加剂来使用。然而,近年来,由于在禽畜饲养过程中对的盲目过量使用,中毒事件时有发生。乙酰甲喹属于喹噁啉类化合物,它的类似物卡巴氧和喹乙醇由于具有致突变和致癌作用已经被禁用,乙酰甲喹的潜在毒性仍缺乏有力的分子依据。本实验室前期研究显示,CYP450与乙酰甲喹代谢密切相关。本文将筛选确定猪体内与乙酰甲喹代谢密切相关的CYP450亚型,并加以功能验证,阐明其催化机制。内容与方法:首先,我们用乙酰甲喹处理培养中的原代猪肝细胞,24小时后收集细胞提取RNA,用荧光定量PCR法检测目的基因的表达水平相比于空白对照组的变化,从而筛选确定与乙酰甲喹代谢相关的CYP450亚型,即CYP3A22。然后,利用重组腺病毒技术使CYP3A22在原代猪肝细胞中高表达,分别将正常的原代猪肝细胞和高表达CYP3A22的原代猪肝细胞孵育乙酰甲喹后,用流式细胞仪分析乙酰甲喹对细胞周期的影响及高表达CYP3A22后乙酰甲喹对细胞的影响。最后,通过液质联用分别检测由CYP3A22腺病毒感染和不感染的原代猪肝细胞孵育乙酰甲喹后的代谢产物,进一步验证CYP3A22在乙酰甲喹代谢过程中的催化作用。结果:乙酰甲喹处理后的猪肝细胞,用荧光定量PCR法检测到CYP3A22基因明显上调,因此对CYP3A22与乙酰甲喹代谢的关系进行进一步验证。我们发现乙酰甲喹能够导致猪肝细胞的G2期积累现象,而用重组腺病毒感染猪肝细胞使CYP3A22高表达后却能够逆转这一现象,说明CYP3A22可能参与了乙酰甲喹的解毒过程。并且用液质联用检测发现,CYP3A22腺病毒感染后的原代猪肝细胞孵育乙酰甲喹后1h和6h一次出现了羟化产物和在羟化基础上的羰基还原产物,进一步证明CYP3A22催化了乙酰甲喹的解毒代谢过程。结论:本研究使用重组腺病毒体系在细胞中成功表达了CYP3A22蛋白质,探索到CYP3A22参与了乙酰甲喹的解毒过程,并验证其主要参与的过程为乙酰甲喹2'-乙酰基的羟化反应,进而发生羰基还原这一主要的解毒反应。
【作者单位】:江西医学高等专科学校
【分类号】:S859.7

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