《广州大学》 2019年
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蛋白水解法产生的稳定性抗氧化多肽及功能分析

黄靖怡  
【摘要】:多肽类抗氧化剂由于其抗氧化效率远远高于非多肽类抗氧化剂而成为具有广泛应用价值的抗氧化活性成份,但是活性多肽和多数活性蛋白一样往往在高温等极端应用环境下不够稳定,这已成为制约其在化妆品、保健品及药品中广泛应用的最主要因素。本项目通过酶解法及高温筛选,从酪蛋白中获得能够在高温下保持良好抗氧化活力的稳定性生物活性肽,并对其生理功能及结构组成进行分析,为抗氧化肽功能特性的发掘及温度耐受机制的研究提供参考,也为功能性食品的开发应用奠定基础。研究结果如下:1、采用单因素及正交试验,以超氧阴离子自由基、DPPH·自由基及羟自由基清除能力为检测指标,对酪蛋白水解条件进行优化,在底物浓度10%、55℃、pH 6.5、反应时间4 h、酶用量35μL的条件获得了抗氧化活性较高的蛋白水解产物。2、确定了耐高温抗氧化多肽的筛选条件。对优化水解条件所得抗氧化活性较高的水解产物进行70、80、90、100℃高温筛选,以3种自由基清除能力为指标,确定水解组合A_3B_2C_1D_3在100℃处理25 min后,得到具有良好温度耐受性及抗氧化活性的水解产物,该产物在121℃超高温处理5 h后仍保持较高生物活性。3、运用反相高效液相色谱法对不同高温处理后的抗氧化多肽组分进行差异性分析,根据峰保留时间对RSD%在3%以内的色谱峰定义为同一类别物质特征峰,5个温度处理共获得37个特征峰。其中,100℃及121℃处理后分别获得11、8个峰,定义为耐高温及耐超高温多肽特征峰,且100℃处理样品显示出较强的疏水性。4、细胞水平的研究发现:该耐高温抗氧化多肽对H_2O_2诱导损伤的HUVE细胞有保护效果。样品预处理24 h后再进行损伤处理,与损伤模型组相比,细胞存活率提高了36.2%,LDH释放降低51.37%。且能有效提高细胞氧化还原酶系中的SOD活力、CAT活力及GSH含量(P0.05)。Western blot结果显示该多肽可使细胞凋亡因子Caspase-3表达降低(P0.05)。5、利用葡聚糖凝胶层析法和DEAE离子交换色谱法对耐高温抗氧化多肽进行分离纯化,共获得8个分离峰,抗氧化能力检测发现其中峰7对应组分抗氧化活性较高。SDS-PAGE电泳结果显示,该组分包含4种分子量多肽。6、耐高温抗氧化多肽及DEAE离子交换色谱分离的高抗氧化活性组分质谱检验结果显示,根据GO注释,共鉴定到3种抗氧化相关多肽,分别为乳过氧化物酶和两α_(S1)-酪蛋白。其理化性质、氨基酸组成、疏水性、信号肽、二级结构的预测结果显示,3种耐高温抗氧化多肽的谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸含量较高,而色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸和半胱氨酸的含量较少。三种多肽均为亲水性蛋白,主要由构成α-螺旋和无规卷曲的氨基酸组成;其中,两α_(S1)-酪蛋白具有信号肽。
【学位授予单位】:广州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ936.16

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