《河南大学》 2019年
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抗人Tim-1抗体在埃博拉和马尔堡假病毒感染中的作用及抗体优化研究

张艳玲  
【摘要】:背景埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)均是单链RNA病毒,隶属丝状病毒科,可感染人类、非人类灵长类动物和其他哺乳动物。该病毒引发的埃博拉病毒出血热和马尔堡病毒出血热是一类严重且致死率极高的烈性传染性疾病,可使机体产生严重的免疫抑制和病理损伤,最终导致多器官功能衰竭和休克,并且发病进程很快。埃博拉病毒和马尔堡病毒自爆发以来,主要分布在非洲地区。但是随着经济全球化的发展,埃博拉病毒和马尔堡病毒已经突破地域的局限,给世界各国带来了极大的疾病蔓延风险和威胁。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子1(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing,Tim-1)是Tim蛋白家族的关键成员,主要表达于CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、自然杀伤细胞(Natural Killer cells,NKs)、巨噬细胞、树突状细胞(Dendritic cells,DCs)、B细胞和肥大细胞等细胞表面,与其配体磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)以及其家族成员Tim-4等分子结合后可介导凋亡细胞的清除、T细胞的活化、增殖以及细胞因子的分泌,并且与多种免疫功能障碍有关。最近研究发现Tim-1分子可作为多种烈性逆转录病毒的表面受体,通过与病毒胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)之间的相互作用介导病毒附着到宿主细胞,从而促进病毒的感染,如丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒(DENV)、埃博拉病毒(EBOV)、马尔堡病毒(MARV)、和寨卡病毒(ZIKV)等。抗体库技术的问世,为生物制药产业带来了重大的突破,在临床医学领域具有广阔的应用前景,其基本原理是利用PCR、定点突变、DNA序列分析、转化、转染等基因工程技术将抗体的基因型与表型偶联,在一定的筛选条件下,从抗体库中筛选针对抗原的特异性抗体基因,富集具有高亲和力和高效力的抗体。目前,哺乳动物细胞展示平台是真核表达抗体库展示平台中应用最广泛的技术,其蛋白质翻译后加工体系适用性更高,表达的抗体更接近于天然抗体,常用于全长抗体库筛选,经其筛选获得的抗体与机体产生的天然抗体结构类似,具备了天然抗体的特性,在抗体研发方面发挥着不可小觑的作用。埃博拉、马尔堡等急性病毒严重威胁人们的生命健康,因此,迫切需要针对病毒感染机制探索新的干预药物及相应的药物评价方法。在前期研究中,本实验室成功构建了抗人Tim-1的质粒,然后利用真核细胞表达系统纯化出了抗人Tim-1抗体,利用埃博拉、马尔堡假病毒技术对该抗体进行功能评价,同时利用计算机辅助分子设计和分子生物学技术,通过哺乳动物细胞展示系统构建抗人Tim-1抗体库,期望筛选出高亲和力和生物学效能的抗人Tim-1抗体,为抗人Tim-1抗体的研发奠定一定的基础。目的利用假病毒技术评价抗人Tim-1抗体在埃博拉、马尔堡假病毒感染中的防治作用,同时利用计算机辅助分子设计和分子生物学技术构建抗人Tim-1抗体库,并通过高通量测序技术检测抗体库的质量,借助流式细胞分选技术对抗人Tim-1抗体库进行高效筛选,以获得比抗人Tim-1母本抗体亲和力更高、功能更强的抗人Tim-1抗体,为抗人Tim-1抗体的开发应用提供新的实验依据。方法(1)采用人工脂质体法分别转染EBOV-GP质粒和MARV-GP质粒,制备埃博拉和马尔堡假病毒。(2)采用TCID_(50)方法检测埃博拉、马尔堡等假病毒滴度,利用Reed-Muench法计算埃博拉、马尔堡假病毒滴度值。(3)采用人工脂质体法转染hTim-1质粒,制备高表达Tim-1的HEK-293T细胞,通过FACS实验、实时定量PCR和Western印迹实验三种方法检测其转染效率。(4)采用假病毒感染技术感染hTim-1高表达的HEK-293T细胞,通过双荧光素酶报告基因实验检测靶细胞荧光值。(5)真核表达抗人Tim-1抗体,通过考马斯亮蓝染色实验鉴定纯化后的抗人的Tim-1抗体,ELISA及FACS实验证实其与Tim-1抗原结合特异性。(6)假病毒感染技术和双荧光素酶报告基因实验检测抗人Tim-1抗体对埃博拉和马尔堡假病毒的抗感染活性。(7)假病毒感染技术和双荧光素酶报告基因实验检测抗人Tim-1抗体与埃博拉和马尔堡假病毒特异性抗体的协同作用。(8)利用分子生物学技术构建人源Tim-1哺乳动物细胞膜展示抗体库和抗人Tim-1母本抗体质粒。(9)采用流式细胞分选技术高效筛选抗人Tim-1抗体库。(10)提取抗人Tim-1抗体库总的DNA。(11)通过真核细胞表达系统表达抗人Tim-1抗体。(12)FACS检测抗人Tim-1抗体与抗原的亲和力。结果(1)通过双荧光素酶报告实验分别检测埃博拉和马尔堡假病毒感染活性,结果显示成功获得了感染活性良好的埃博拉、马尔堡等假病毒。(2)利用Reed-Muench法计算埃博拉假病毒的TCID_(50)为1×10~(-1.71)/0.1mL,马尔堡假病毒的TCID_(50)为1×10~(-4.25)/0.1mL。(3)通过FACS实验、Q-PCR实验和Western blot印迹实验三种方法检测hTim-1质粒转染效率,结果显示hTim-1质粒转染效率与其转染质量呈正相关,成功获得了高表达人Tim-1的HEK-293T细胞。(4)HEK-293T细胞转染hTim-1质粒和Vector质粒后,分别感染埃博拉、马尔堡等假病毒。结果表明:hTim-1高表达的HEK-293T细胞对埃博拉、马尔堡等假病毒易感活性显著提高。(5)真核表达抗人Tim-1抗体后,经考马斯亮蓝染色实验鉴定,还原电泳分别得到55kDa和26kDa两条带,非还原电泳在180kDa以上有一条带,与IgG对照抗体位置一致,结果表明本实验室成功表达了抗人Tim-1抗体。通过ELISA检测及FACS实验证实其抗原抗体的特异性结合。(6)采用不同浓度的抗人Tim-1抗体中和埃博拉和马尔堡假病毒的感染。结果表明:与蓖麻毒素对照抗体相比,抗人Tim-1抗体显示出良好的中和埃博拉、马尔堡假病毒感染的效果(7)采用不同浓度的抗人Tim-1抗体与埃博拉和马尔堡假病毒特异性抗体联合使用检测埃博拉和马尔堡假病毒的感染效果。结果显示:与蓖麻毒素对照抗体相比,抗人Tim-1抗体与埃博拉和马尔堡假病毒特异性抗体联合使用,可以显著抑制埃博拉和马尔堡假病毒的感染HEK-293T细胞,表明抗人Tim-1抗体与埃博拉和马尔堡假病毒特异性抗体具有良好协同作用。(8)利用分子生物学技术成功构建了人源Tim-1哺乳动物细胞膜展示抗体库,其库容量为2.8×10~8,同时也成功构建了抗人Tim-1母本抗体质粒。(9)采用流式细胞分选技术对抗人Tim-1抗体库进行4轮流式分选,获得与抗人Tim-1母本抗体亲和力相似,但含有全新抗人Tim-1抗体序列的CHO细胞。(10)对经过4轮流式分选后的CHO细胞进行总的DNA细胞提取,获得与抗人Tim-1母本抗体亲和力相似的抗人Tim-1抗体库质粒。(11)将筛选出的全新序列的抗人Tim-1抗体质粒与真核表达载体连接后,成功表达了与Tim-1母本抗体不同的抗人Tim-1抗体。(12)FACS实验成功筛选出与抗人Tim-1母本抗体亲和力相似的抗人Tim-1抗体。结论本研究通过真核表达和蛋白纯化技术制备了抗人Tim-1抗体,通过假病毒感染技术检测抗人Tim-1具有良好的中和埃博拉和马尔堡假病毒感染的作用。但是,与埃博拉和马尔堡特异性抗体相比较,我们制备的抗人Tim-1抗体对埃博拉和马尔堡病毒的抑制作用还有待加强。为进一步优化抗人Tim-1抗体功能作用,我们利用计算机辅助分子设计技术和分子生物学技术成功构建了抗人Tim-1抗体库,并通过高通量测序技术检测抗体库的质量,借助流式细胞分选技术对抗人Tim-1抗体库进行高效筛选,获得了与Tim-1母本抗体亲和力相似的抗人Tim-1抗体库,为抗人Tim-1抗体的开发应用提供了新的依据。
【学位授予单位】:河南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R373

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